QbD在MSC工艺开发中的核心步骤与实践要点
质量源于设计（QbD）：MSC工艺开发的核心步骤与实践
摘要
本文围绕间充质干细胞（MSC）工艺开发，系统阐述质量源于设计（QbD）理念的应用路径，涵盖关键质量属性（CQA）识别、关键工艺参数（CPP）控制及工艺验证等核心环节，并结合实际案例分享实践中的经验与挑战。
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MSC作为CGT赛道核心产品，其CMC申报是审评重点难点。本文QbD框架可直接指导企业工艺开发与申报策略，建议CRO及药企研发部门重点参考。
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正文
在细胞与基因治疗（CGT）领域，MSC正成为再生医学最具潜力的赛道之一。从骨关节炎到组织损伤修复，从自身免疫疾病到抗衰老应用，MSC的临床价值正在被不断验证。
国务院先后发布的第818号令和第828号令，共同构建了中国细胞与基因治疗（CGT）领域的“双轨制”监管体系，标志着我国细胞治疗正式迈入“合规+创新”双轮驱动的黄金发展期。
赛多利斯作为国际生物制药研究及生物药行业的领先合作伙伴，从前期研发到商业化生产，正在帮助全球的生物技术科学家和工程师研发和生产药物。在MSC工艺开发中，赛多利斯推出了稳健的、符合QbD理念的MSC工艺解决方案。
2026年05月CDE发布了《间充质干细胞产品药学研究与评价技术指导原则（征求意见稿）》，其中在生产工艺章节提出：“应遵循QbD的理念进行生产工艺开发，明确目标产品质量概况（quality target product profile, QTPP），对影响产品质量的生产工艺进行研究和验证，并基于工艺理解、科学原理和质量风险管理，确定生产工艺控制策略。”[1]
QbD的起点是目标产品质量概况QTPP。简单说，我们最终想要的产品是什么样的，它通常涵盖临床用途、剂型与规格、质量属性、安全性要求和稳定性等维度。在QTPP确定后，下一步便是识别关键质量属性（Critical Quality Attributes, CQAs）——哪些对产品的安全性、有效性或一致性有决定性影响的物理、化学、生物学或微生物学属性。识别了CQAs之后，就要回答：哪些工艺参数和物料属性会影响这些CQAs？影响有多大？基于风险评估的结果，结合文献数据和前期经验，我们就可以设定各工艺参数的初步可接受范围。"初步范围"不是最终的设计空间。后续需要通过DoE（实验设计）来验证和优化，找到真正的"安全操作区间"。在最终设计空间确定后，会进行商业化规模的工艺验证，以确保产品质量都能得到保证。
以MSC微载体悬浮培养工艺的开发为例，在MSC的工艺开发通常会有以下几个步骤：
1
细胞库是整个工艺的起点，也是QbD框架中关键物料属性（Critical Material Attributes, CMA）的核心载体。一个设计良好的细胞库体系，能从源头上锁定产品质量的基线。
2
使用FMEA（失效模式与影响分析）工具，结合文献数据和前期经验，初步设定各pH、溶氧、微载体密度和接种细胞密度等初步工艺范围。
3
以初步工艺为基础，进行微载体和培养基的"设计式筛选"，选定关键物料，并建立物料属性与产品CQAs的量化关系。
4
使用DOE方法对影响产品质量的工艺参数进行研究和优化，并基于工艺理解、科学原理和质量风险管理，确定生产工艺控制策略。
对商业化规模生产进行放大培养研究、优化和验证。
01
培养基
培养基是间充质干细胞（MSC）体外培养体系的核心物料，不仅为细胞提供基础营养与生长微环境，更直接决定细胞的增殖效率、表型稳定性与功能活性，是 MSC 制备工艺的核心质量源头。培养基的营养配比、生长因子浓度及渗透压参数，直接调控 MSC 的细胞周期进程与群体倍增时间，是实现细胞规模化扩增、满足临床给药剂量需求的核心前提。
MSC NutriStem®是赛多利斯专门用于MSC培养的无血清无异种成分的化学限定培养基。即使在初始接种细胞密度低的情况下，也能表现出卓越的生长优势。而且也适用于高质量的外泌体（EVs）。
以MSC NutriStem®分别进行不同来源（BM和AT）的MSC进行细胞培养，从下图可以看到：在低细胞密度接种后Day5，MSC NutriStem®培养的细胞密度远高于竞品；在AT来源的MSC细胞连续传代实验中，MSC NutriStem®在P1-P4代内获得的细胞密度高于竞品[2]，未出现细胞密度下降的情况。
02
微载体
微载体具备极高的比表面积，可在单位体积的生物反应器中提供数倍于多层细胞工厂的培养面积，显著提升 MSC 的单位体积产量与整体扩增倍率，是实现临床级 MSC 批量生产的核心支撑。
市售的微载体多种多样，按照微载体的表面特征可以分为一下四种：
1
刚性实心载体通常为交联聚苯乙烯等，这类材质是常见的2D细胞培养瓶或者细胞工厂的基质，在微载体使用过程中，通常不进行清洗或者孵育，湿热灭菌后直接使用。
2
软性实心载体以交联葡聚糖为主，通常载体表面具有电荷修饰。微载体在使用前需要经过PBS等溶胀---PBS清洗---湿热灭菌---培养基预孵等步骤。在培养过程中，存在微载体粒径不均一或者搅拌转速过高造成的微载体破碎等现象。
3
常见的微孔载体多以明胶基质为主。表面微孔不能支持细胞由载体表面向内生长。使用过程中也需要PBS溶胀和培养基的预孵。明胶基质可以经过胰酶完全酶化，便于收获MSC细胞。但明胶酶化后分解为小分子物质，是工艺中引入的外源性物质，需要在工艺设计中进行风险控制。
4
大孔载体的基质种类繁多：硅土增重的高密度乙烯、交联纤维素或重组胶原等。前者无法进行酶化或裂解，而重组胶原可以加入特定的裂解液便于细胞收获。但重组胶原在使用前需要加入培养基溶胀和预孵。溶胀过程可能存在表面漂浮的微载体无法沉降，在细胞贴壁过程中不能贴敷或者少量贴敷细胞，造成贴壁面积上的损失。其次，虽然重组蛋白能够酶化或者裂解，但裂解产物被释放在MSC细胞悬液中，在工艺中引入的外源物质。即使MSC细胞进行了漂洗，也需要在工艺开发中制定该重组蛋白的检测方法和临床安全限度的实验，以控制产品风险。
赛多利斯SoloHill®系列的微载体均为刚性的交联聚苯乙烯，在此基础上分别进行了电荷修饰或者胶原包被，以便适应于不同的细胞贴敷。该系列的产品种类如下表：
SoloHill®系列微载体已有疫苗或干细胞产品使用30余年的历史。
在MSC 2D培养转移至3D培养的案例中，研究人员使用MSCs（WJ）的细胞进行复苏后，经2个T型方平和1个细胞工厂传代后，使用Collagen微载体在Biostat® B罐Univessel® SU和Univessel® Glass上分别进行培养，24H细胞贴敷率均＞80%[3]，说明了Collagen微载体具有优异的细胞贴壁性能。
在MSC工艺开发的前期，通常需要进行培养基和微载体的筛选，以及培养工艺的研究和后续的优化实验。这些过程中需耗尽大量的时间和物料成本进行实验。
Ambr® 250HT高通量自动化微型生物反应器，配备了12位或24位250ml微型生物反应器系统，可以加速工艺开发，提高数据质量，缩短上市周期，同时最大程度降低后期大规模生产失败的巨额风险，因此非常适用于工艺开发
Ambr® 250HT同时可以搭配MODDE® DOE设计和分析软件和SIMCA® MVDA分析软件，在工艺开发中帮助使用者科学设计实验，减少实验次数，并对实验中的影响因子进行相关性分析。SIMCA®便于使用者分析培养参数中的交互效应和建立工艺中的“黄金批次”，更深入的解释各参数和批次差异对CQAs的影响。
培养基与微载体的筛选
在一项市售微载体和MSC培养基的筛选实验中，研究人员使用Ambr® 250HT HT快速实现培养基和微载体的筛选，并确定了其和接种细胞密度对细胞倍增倍数的相关性。
项目使用Ambr® 250HT，同时运行12个独立罐体（BR1-BR12）,实验的条件如下：
实验运行中，对BR1-BR12使用机械臂自动取样，按照相同的方法进行细胞计数和细胞倍增倍数计算，最后绘制D1-D6的曲线如下图：
从上图可以看到：BR12和BR9在D6的VCC（活细胞密度）最高，BR8在D6的Expansion rate(细胞倍增倍数)最高，为25倍倍增。BR8、BR9和BR12均采用了MSC NutriStem®+Collagen的培养体系，可以说明该组合在支持细胞生长和倍数上具有一定的优势。
后续我们使用SIMCA® MVDA软件，分析实验中的培养基、微载体以及接种细胞密度对细胞倍增的响应，可以获得下图：
Coeff CS为正值的，说明该项对细胞倍增的响应为正向积极作用，柱状图越高其响应越高。在正相关中Medium(Sartorius),其次为Collagen，这也正印证了在D6的VCC和Expansion rate中，NutriStem®+Collagen的培养体系表现优异的原因。其次也可以看到Seeding density（接种细胞密度）为负相关，如此也科学的解释了虽然BR12和BR9 VCC高但是Expansion rate并不显著的原因是细胞接种细胞密度。
培养工艺参数研究
MSC工艺开发中，在培养基和微载体确定后会对微载体密度、接种细胞密度，搅拌转速等作为影响因子进行相关的研究。影响因子数量和水平决定了实验的数量。若使用正交的方式进行实验，实验数量通常几何式的增长，给实验的设计照成显著的难度。
MODDE® DOE软件能够软件覆盖全因子设计、响应面设计（RSM）、最优设计、混料设计、空间填充设计等全类型方案，可适配因子筛选、工艺参数优化、稳健性验证等全开发阶段。还可根据实验预算、操作限制自定义实验规模，支持添加中心点、区组、重复实验来评估纯误差，科学的减少实验次数。结合Ambr® 250HT高通量微型反应器快速攻克工艺开发。
以下的案例为MSC工艺开发中使用Ambr® 250HT和MODDE® DOE软件进行实验设计和数据分析。实验设计中的影响因子和影响水平如下[4]：
在实验结束后，我们将实验过程的VCD输入MODDE®软件中，将VCD作为响应，评价各影响因子对VCD的相关性。
从图中可以看到，溶氧和收获时间的正相关性较为显著，搅拌转速的负相关性较为显著[4]。
MODDE®软件提供了诸如甜点图等工具。由于DO 浓度和搅拌速度对 VCD 的影响最大，因此在以下关于最佳工艺范围的预测中将这两个因素作为变量，而其他因素保持不变。甜点图突出显示了 DO 和搅拌速度的范围 (以绿色显示)，这些范围产生了预定义的工艺目标:VCD>0.3E6 cells/ml，倍增倍数>10，的参数范围。
接下来我们使用该预测的DO 和搅拌速度在不同供体来源的MSC上进行了验证[4]。
上图可知不同供体来源的MSC细胞，BM2和UC3获得了VCD>0.5E6 cells/ml，虽然BM1的VCD约为0.3E6 cells/ml，但在目标范围内。将以上培养批次进行表面标识物的表型分析如下：
伴随MSC“双轨制”的产业路线逐渐清晰，作为一种标准化的药品，《间充质干细胞产品药学研究与评价技术指导原则（征求意见稿）》明确了在MSC在工艺开发过程中需要对影响产品质量的生产工艺进行研究和验证。
赛多利斯作为国际生物制药研究及生物药行业的领先合作伙伴，具有成熟、稳健的MSC工艺解决方案。此外，赛多利斯拥有在MSC、EVs工艺开发中经验丰富的PD部门。PD部门可依据赛多利斯成熟的解决方案和客户特定的工艺背景，帮助客户初步建立工艺或者进行工艺研究。如需此类Paid Service服务，请扫描下方二维码与我们联系。
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参考文献：
1. 《间充质干细胞产品药学研究与评价技术指导原则（征求意见稿）》, 国家药品监督管理局药品审评中心,2026.05
2. App Note: A Complete Xeno-Free, Serum-Free System for the Growth and Expansion of hMSCs.Sartorius.2021
3. App Note：2D to 3D Transition of Mesenchymal Stem Cell Expansion Process using the Sartorius MSC Pilot Solution. Sartorius.2021
4. App Note：Scalable MSC Suspension-Based Process Optimization using the Sartorius MSC Optimization and Characterization Solution. Sartorius.2021