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寡核苷酸药物生物分析前处理攻略：磁萃取技术原理、应用与选择策略

发布于 2026/10/19 07:30:00（北京时间）

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摘要

● 前言在寡核苷酸药物的药代动力学和毒代动力学研究中，LC-MS/MS技术凭借其优越的特异性及灵敏度，已成为生物分析的主流平台[1-3]。然而，高灵敏度的检测离不开高效的样本前处理，其核心目的是去除

正文

● 前言

在寡核苷酸药物的药代动力学和毒代动力学研究中，LC-MS/MS技术凭借其优越的特异性及灵敏度，已成为生物分析的主流平台[1-3]。然而，高灵敏度的检测离不开高效的样本前处理，其核心目的是去除生物基质（如血浆、尿液、组织等）中的干扰物质，并对目标寡核苷酸进行富集和浓缩。

寡核苷酸药物水溶性高、富含负电荷、易与蛋白非特异性结合，这些理化特性给前处理带来独特挑战。传统的蛋白沉淀法（PPT）难以实现有效提取；液液萃取法（LLE）虽操作简便，但内源性干扰物容易被共提取，尤其在处理组织匀浆和排泄基质时基质效应显著；固相萃取法（SPE）净化效果较好，但处理过程繁琐、耗时较长。

为克服上述局限，磁性固相萃取技术（mSPE）提供了一条新的解决路径。该技术结合了磁性载体与SPE的优势，在有效净化样本的同时便于实现自动化操作，展现出巨大的应用潜力。本文将从磁萃取技术的原理出发，系统阐述寡核苷酸药物提取中的三种核心作用机制（碱基互补配对、离子交换、疏水相互作用）及其适用场景，并通过实际案例对比不同前处理方案的应用效果，为寡核苷酸药物生物分析方法的选择提供参考。

磁性固相萃取的原理与技术优势

磁性固相萃取（magnetic-solid phase extraction，mSPE）是一种基于液固色谱理论的新型分散固相萃取技术。它利用磁性或可磁化的材料作为吸附剂，通过外部磁场即可实现对目标分析物的快速富集。磁性固相萃取中的关键试剂——磁性吸附剂（磁珠）由氧化铁的磁核和包被了特殊基团的壳层组成。不同的基团结构决定了与待测物作用机理及强度的差异，从而影响提取或洗脱效率。图1为寡核苷酸药物与键合了不同基团的磁珠相互作用的示意图。

图1. 寡核苷酸与不同官能团磁珠相互作用示意图

mSPE的基本原理如图2所示[4]：将磁性吸附剂添加到样本溶液或悬浮液中，目标分析物通过特定作用力被吸附至分散的吸附剂表面；在外部磁场作用下，目标分析物随吸附剂一起迁移；用清洗溶液去除杂质后，再用合适的洗脱溶剂将目标分析物洗脱下来，实现样本的富集和纯化。

图2. 磁性固相萃取的原理示意图[4]

与传统的LLE和SPE相比，mSPE具有以下显著优势：

传质效率高：磁珠比表面积大，传质速度快，可在短时间内从大体积样本中吸附目标化合物；

操作便携：通过外加磁场即可实现快速分离和收集，避免繁琐的过滤或离心步骤，更易于实现自动化；

样本洁净度高：在提取后，样本洁净度及特异性等方面优势明显，可有效降低基质效应。

目前，该技术已广泛应用于生物医药、食品安全及环境监测等领域。

三种磁萃取技术的原理与适用场景

基于寡核苷酸理化特性，磁萃取技术按作用机理可分为碱基互补配对、离子交换、疏水相互作用三类。三种萃取模式的性能各有侧重，可根据不同实验分析目标选用适配方案，实现灵活高效的样本前处理。

碱基互补配对法（杂交捕获）

原理

碱基互补配对法，又称核酸杂交法（nucleic acid hybridization），是指两条具有一定序列同源性的单链核酸在合适条件下，按碱基互补原则重新配对形成双链的过程。

基于PNA探针的核酸杂交捕获流程如图3[5]所示：

将样本中的双链siRNA加热变性；

加入生物素标记的捕获探针，在适当离子强度和退火温度下，探针与目标序列特异性互补配对；

加入链霉亲和素包被的磁珠，基于生物素-链霉亲和素特异性亲和作用，形成磁珠-探针-目标核酸复合物；

借助磁分离吸附磁珠，用洗涤缓冲液反复清洗，去除未结合的非目标核酸、杂质及游离探针；

借助洗脱缓冲液及高温条件，促使捕获探针与目标核酸解离，回收富集目标核酸。

图3. 基于PNA探针的核酸杂交捕获流程示意图[5]

技术特点

该方法的核心优势在于：

◉ 特异性强：依靠严格的碱基互补配对精准识别目标序列，可有效区分同源序列、避免交叉反应；

◉ 灵敏度高：可检测微量DNA/RNA，适合低丰度样本；

◉ 操作安全性高：反应在水相体系中进行，条件温和、流程标准。

主要挑战

◉ 实验条件要求严苛：探针设计、反应温度、试剂质量、盐离子浓度等因素对结果重现性影响较大；

◉ 流程耗时较长：需经过变性、杂交、清洗、洗脱等多步操作，通量受限。

关键影响因素

开发该方法时，需重点关注以下参数：

探针设计：探针长度应适中，碱基组成需合理，避免形成二聚体或发夹结构，确保与靶序列高度特异性匹配；

杂交温度：需严格控制杂交温度（通常参考Tm值），温度过高会导致结合效率下降，过低则易引发非特异性结合；

盐离子浓度调控：适宜的离子强度有助于维持杂交复合物的稳定性，增强结合强度与特异性；

充分变性：确保双链核酸完全解链是探针与目标序列有效结合的前提。

适用场景

该方法主要适用于对灵敏度要求高、基质背景干扰大的寡核苷酸样本提取，以及作为常规LLE和SPE法无法有效提取时的补充方案。

离子交换法

原理

离子交换法（Ion exchange interaction）基于寡核苷酸药物磷酸骨架的磷酸根基团，在弱酸性环境下与磁珠表面修饰的阳离子基团通过静电相互作用结合，实现目标化合物的提取。其作用机理如图4所示。

提取流程如下：

向样本中加入蛋白变性剂，使siRNA从蛋白上解离；

加入酸性缓冲液调节pH至弱酸性；

加入表面修饰有阳离子基团的磁珠，使其与目标寡核苷酸结合，形成磁珠-核酸复合物；

通过磁分离吸附磁珠，并使用洗涤缓冲液反复清洗，以去除未结合的非目标核酸及其他杂质；

在弱碱性环境下进行洗脱，使阳离子基团恢复中性，目标寡核苷酸从磁珠上解离，从而实现目标核酸的回收与富集。

图4. 阴离子交换机理示意图

技术特点及关键影响因素

该方法操作简便，能实现捕获-清洗-洗脱的自动化操作；样本洁净度高，能有效解决基质效应问题；适用性强，对于血浆、组织匀浆、胆汁、尿液等基质均能获得理想提取效果。

方法开发中需重点关注：

◉ 变性剂的选择与用量，避免其占据磁珠捕获位点；

◉ 捕获pH环境的细致优化，其最适窗口较窄且因核酸药物而异；

◉ 洗脱液的优化，需在适宜碱性条件下使阳离子基团呈中性，以实现理想洗脱。

适用场景

适用于样本量较大、通量要求较高以及基质效应较严重的胆汁、尿液、组织匀浆等基质中寡核苷酸药物的提取。

疏水相互作用

原理

疏水相互作用（hydrophobic interaction）中，寡核苷酸药物首先与碱性离子对试剂通过静电作用形成配对离子，随后离子对试剂的疏水端与磁珠上键合的疏水基团通过疏水作用力结合，实现目标寡核苷酸提取。其作用机理如图5所示。

提取流程如下：

向样本中加入RNA提取剂，使siRNA从蛋白上解离；

加入一定浓度的碱性离子对试剂，使其与寡核苷酸分子形成配对离子；

加入表面键合了疏水基团的磁珠，通过疏水作用力形成磁珠-核酸复合物；

通过磁分离吸附磁珠，并使用洗涤缓冲液反复清洗，以去除未结合的非目标核酸及其他杂质；

在强碱环境下使用有机溶剂进行洗脱，破坏静电及疏水作用力，使目标核酸解离。

图5. 疏水相互作用机理示意图

技术特点

通常，样本经RNA提取剂处理后，取水相用于疏水磁珠捕获。该方法的核心优势在于能有效消除胆汁、尿液、组织匀浆等复杂基质的基质效应。相较于离子交换法因需加入过量变性剂而导致的回收率降低，疏水相互作用法通过萃取处理后直接取水相捕获，可有效规避此问题。对于脂质修饰的寡核苷酸，因脂质疏水基团的助力，可获得更理想的提取效果。

关键影响因素

方法开发中需重点关注：

◉ 避免大量引入破坏疏水作用力的有机溶剂或表面活性剂；

◉ 碱性离子对浓度及种类；

◉ 温度对上样和洗脱步骤的影响。

适用场景

该方法同样适用于基质效应比较严重的胆汁、尿液及组织匀浆等样本，特别是对于离子交换法无法获得理想回收率的组织匀浆基质；对于脂质修饰的寡核苷酸，该方法的提取效果优于离子交换法。

磁萃取技术的应用效果与方法选择策略

为直观比较不同前处理方法的实际性能，以GalNAc修饰的siRNA Inclisiran为模型药物，分别采用LLE、SPE及三种mSPE方法（碱基互补配对、离子交换、疏水相互作用）提取大鼠血浆和尿液样本中的目标物。提取后的样本在相同色谱质谱条件下（液相色谱Waters ACQUITY UPLC I- Class PLUS系统；三重四级杆质谱Sciex triple QuadTM 6500+）进行分析，监测AS链591.13/79.0离子通道。各方法在最低定量下限（LLOQ）、提取回收率、基线背景及干扰峰数量等方面的对比结果汇总于表1。

表1. 五种前处理方法处理大鼠血浆及尿液样本中Inclisiran的效果对比

血浆样本分析

对于含有10 ng/mL Inclisiran的血浆样本（杂交捕获法浓度为2 ng/mL），五种方法的回收率无显著差异，但基线背景和干扰峰数量差异明显（如图6至图10）。综合来看，提取后样本的洁净度从高到低（即干扰由少到多）依次为：mSPE-碱基互补配对法＞mSPE-离子交换法≈mSPE-疏水相互作用≈SPE＞LLE。磁萃取法显著降低了基线干扰，可以通过缩短色谱分离时间提高分析通量。

图6. LLE处理10 ng/mL Inclisiran AS链的血浆样本色谱图

图7. SPE处理10 ng/mL Inclisiran AS链的血浆样本色谱图

图8. mSPE-碱基互补配对法处理2 ng/mL Inclisiran AS链的血浆样本色谱图

图9. mSPE-离子交换法处理10 ng/mL Inclisiran AS链的血浆样本色谱图

图10. mSPE-疏水相互作用处理10 ng/mL Inclisiran AS链的血浆样本色谱图

尿液样本分析

在Inclisiran尿样中，五种方法的差异更为显著（如图11至图15）。LLE法回收率仅为33.6%，且基线噪音较高，难以满足10 ng/mL的检测要求；SPE法基线背景降低，LLOQ可达10 ng/mL；采用mSPE后可进一步降低背景，LLOQ可下探至5 ng/mL；而杂交捕获法灵敏度最佳，LLOQ可达2 ng/mL。

图11. LLE处理10 ng/mL Inclisiran AS链的尿液样本色谱图

图12. SPE处理10 ng/mL Inclisiran AS链的尿液样本色谱图

图13. mSPE-碱基互补配对法处理2 ng/mL Inclisiran AS链的尿液样本色谱图

图14. mSPE-离子交换法处理10 ng/mL Inclisiran AS链的尿液样本色谱图

图15. mSPE-疏水相互作用处理10 ng/mL Inclisiran AS链的尿液样本色谱图

方法选择建议

综合上述结果，不同方法的使用场景可归纳如下：

LLE：操作简便，适用于常规血浆样本的初步提取；但对于组织分布和排泄实验相关的基质，在基质效应、干扰、回收率方面存在明显劣势；

SPE：方法成熟、净化能力可靠，可满足大部分生物分析需求，是可靠的备选方案；

mSPE（离子交换/疏水作用力）：在灵敏度、样本洁净度和操作效率上均优于LLE和SPE，尤其适合处理基质复杂（如组织、胆汁、尿液）或对灵敏度有较高要求的样本；

mSPE（杂交捕获）：当需要更高灵敏度时（如低丰度靶标或剂量极低的药物）或者上述前处理方式不满足提取需求时，该方法是首选，但其前处理时间较长，需在方法设计时予以权衡。

磁萃取技术不仅具备优异的净化效果，还展现出良好的自动化适配潜力，可实现从吸附到洗脱的全自动操作，在降低人为误差的同时进一步提升了时效性。

结语

寡核苷酸药物的生物分析对样本前处理提出了独特挑战。本文系统比较了传统方法（LLE、SPE）与新兴的磁性固相萃取（mSPE）技术三种模式的实际性能，并通过Inclisiran案例展示了mSPE在灵敏度、样本洁净度、操作效率及自动化适配等方面的显著优势。在实际应用中，研究人员可根据检测目标和基质复杂度，灵活选择适宜的前处理策略。

基于在寡核苷酸生物分析领域丰富的技术积累与成熟的平台能力，药明康德DMPK可提供从前处理方法开发、验证到样本检测与数据报告的全流程、定制化技术服务，满足不同研发阶段对生物分析方法的个性化需求。

参考文献：

[1] 程忠哲, 姜宏梁. 核酸药物生物分析方法研究进展. 药学学报, 2021, 56(9): 2335-2345.

[2] 孙淑萌, 林琳, 张岱州, 等. 基于液相色谱分离技术的核酸类药物生物分析方法研究进展[J]. 中国药房, 2024, 35(23): 2959-2964.

[3] LIU A W, CHENG M, ZHOU Y X, et al. Bioanalysis of oligonucleotide by LC-MS: effects of ion pairing regents and recent advances in ion-pairing-free analytical strategies[J]. Int J Mol Sci，2022,23(24):15474.

[4] Capriotti A L, Cavaliere C, La Barbera G, et al. Recent applications of magnetic solid-phase extraction for sample preparation[J]. Chromatographia, 2019, 82(8): 1251-1274.

[5] Zifeng Song, Angela Lu, Long Yuan. Analyte and probe melting temperature guided method development strategy for hybridization LC-MS/MS quantification of siRNAs[J]. J. Pharm. Biomed. Anal, 2025, 253:116556．

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寡核苷酸药物生物分析前处理攻略：磁萃取技术原理、应用与选择策略

发布于 2026/10/19 07:30:00（北京时间）

主题标签：未打标（待 AI 补标或人工校正）

摘要

正文

● 前言

磁性固相萃取的原理与技术优势

图1. 寡核苷酸与不同官能团磁珠相互作用示意图

图2. 磁性固相萃取的原理示意图[4]

与传统的LLE和SPE相比，mSPE具有以下显著优势：

传质效率高：磁珠比表面积大，传质速度快，可在短时间内从大体积样本中吸附目标化合物；

操作便携：通过外加磁场即可实现快速分离和收集，避免繁琐的过滤或离心步骤，更易于实现自动化；

样本洁净度高：在提取后，样本洁净度及特异性等方面优势明显，可有效降低基质效应。

目前，该技术已广泛应用于生物医药、食品安全及环境监测等领域。

三种磁萃取技术的原理与适用场景

碱基互补配对法（杂交捕获）

原理

基于PNA探针的核酸杂交捕获流程如图3[5]所示：

将样本中的双链siRNA加热变性；

加入生物素标记的捕获探针，在适当离子强度和退火温度下，探针与目标序列特异性互补配对；

加入链霉亲和素包被的磁珠，基于生物素-链霉亲和素特异性亲和作用，形成磁珠-探针-目标核酸复合物；

借助磁分离吸附磁珠，用洗涤缓冲液反复清洗，去除未结合的非目标核酸、杂质及游离探针；

借助洗脱缓冲液及高温条件，促使捕获探针与目标核酸解离，回收富集目标核酸。

图3. 基于PNA探针的核酸杂交捕获流程示意图[5]

技术特点

该方法的核心优势在于：

◉ 特异性强：依靠严格的碱基互补配对精准识别目标序列，可有效区分同源序列、避免交叉反应；

◉ 灵敏度高：可检测微量DNA/RNA，适合低丰度样本；

◉ 操作安全性高：反应在水相体系中进行，条件温和、流程标准。

主要挑战

◉ 实验条件要求严苛：探针设计、反应温度、试剂质量、盐离子浓度等因素对结果重现性影响较大；

◉ 流程耗时较长：需经过变性、杂交、清洗、洗脱等多步操作，通量受限。

关键影响因素

开发该方法时，需重点关注以下参数：

探针设计：探针长度应适中，碱基组成需合理，避免形成二聚体或发夹结构，确保与靶序列高度特异性匹配；

杂交温度：需严格控制杂交温度（通常参考Tm值），温度过高会导致结合效率下降，过低则易引发非特异性结合；

盐离子浓度调控：适宜的离子强度有助于维持杂交复合物的稳定性，增强结合强度与特异性；

充分变性：确保双链核酸完全解链是探针与目标序列有效结合的前提。

适用场景

该方法主要适用于对灵敏度要求高、基质背景干扰大的寡核苷酸样本提取，以及作为常规LLE和SPE法无法有效提取时的补充方案。

离子交换法

原理

提取流程如下：

向样本中加入蛋白变性剂，使siRNA从蛋白上解离；

加入酸性缓冲液调节pH至弱酸性；

加入表面修饰有阳离子基团的磁珠，使其与目标寡核苷酸结合，形成磁珠-核酸复合物；

通过磁分离吸附磁珠，并使用洗涤缓冲液反复清洗，以去除未结合的非目标核酸及其他杂质；

在弱碱性环境下进行洗脱，使阳离子基团恢复中性，目标寡核苷酸从磁珠上解离，从而实现目标核酸的回收与富集。

图4. 阴离子交换机理示意图

技术特点及关键影响因素

方法开发中需重点关注：

◉ 变性剂的选择与用量，避免其占据磁珠捕获位点；

◉ 捕获pH环境的细致优化，其最适窗口较窄且因核酸药物而异；

◉ 洗脱液的优化，需在适宜碱性条件下使阳离子基团呈中性，以实现理想洗脱。

适用场景

适用于样本量较大、通量要求较高以及基质效应较严重的胆汁、尿液、组织匀浆等基质中寡核苷酸药物的提取。

疏水相互作用

原理

提取流程如下：

向样本中加入RNA提取剂，使siRNA从蛋白上解离；

加入一定浓度的碱性离子对试剂，使其与寡核苷酸分子形成配对离子；

加入表面键合了疏水基团的磁珠，通过疏水作用力形成磁珠-核酸复合物；

通过磁分离吸附磁珠，并使用洗涤缓冲液反复清洗，以去除未结合的非目标核酸及其他杂质；

在强碱环境下使用有机溶剂进行洗脱，破坏静电及疏水作用力，使目标核酸解离。

图5. 疏水相互作用机理示意图

技术特点

关键影响因素

方法开发中需重点关注：

◉ 避免大量引入破坏疏水作用力的有机溶剂或表面活性剂；

◉ 碱性离子对浓度及种类；

◉ 温度对上样和洗脱步骤的影响。

适用场景

磁萃取技术的应用效果与方法选择策略

表1. 五种前处理方法处理大鼠血浆及尿液样本中Inclisiran的效果对比

血浆样本分析

图6. LLE处理10 ng/mL Inclisiran AS链的血浆样本色谱图

图7. SPE处理10 ng/mL Inclisiran AS链的血浆样本色谱图

图8. mSPE-碱基互补配对法处理2 ng/mL Inclisiran AS链的血浆样本色谱图

图9. mSPE-离子交换法处理10 ng/mL Inclisiran AS链的血浆样本色谱图

图10. mSPE-疏水相互作用处理10 ng/mL Inclisiran AS链的血浆样本色谱图

尿液样本分析

图11. LLE处理10 ng/mL Inclisiran AS链的尿液样本色谱图

图12. SPE处理10 ng/mL Inclisiran AS链的尿液样本色谱图

图13. mSPE-碱基互补配对法处理2 ng/mL Inclisiran AS链的尿液样本色谱图

图14. mSPE-离子交换法处理10 ng/mL Inclisiran AS链的尿液样本色谱图

图15. mSPE-疏水相互作用处理10 ng/mL Inclisiran AS链的尿液样本色谱图

方法选择建议

综合上述结果，不同方法的使用场景可归纳如下：

LLE：操作简便，适用于常规血浆样本的初步提取；但对于组织分布和排泄实验相关的基质，在基质效应、干扰、回收率方面存在明显劣势；

SPE：方法成熟、净化能力可靠，可满足大部分生物分析需求，是可靠的备选方案；

结语

参考文献：

[1] 程忠哲, 姜宏梁. 核酸药物生物分析方法研究进展. 药学学报, 2021, 56(9): 2335-2345.

[2] 孙淑萌, 林琳, 张岱州, 等. 基于液相色谱分离技术的核酸类药物生物分析方法研究进展[J]. 中国药房, 2024, 35(23): 2959-2964.

[4] Capriotti A L, Cavaliere C, La Barbera G, et al. Recent applications of magnetic solid-phase extraction for sample preparation[J]. Chromatographia, 2019, 82(8): 1251-1274.

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