Nat. Commun. | 蛋白质设计中配体化学互补性的快速评估

随着深度学习和计算蛋白质设计技术的发展，研究人员已经能够快速生成具有不同折叠结构和功能的人工蛋白质。然而，如何在蛋白质内部构建能够高亲和力、高选择性识别小分子的结合口袋，仍然是从头蛋白质设计面临的重要问题。现有方法往往需要复杂的结构搜索、大量计算资源以及较大规模的实验筛选，难以快速获得具有明确结合功能的候选蛋白。

研究人员提出了一种基于物理化学原理的计算设计方法RASSCCoL，通过快速评估配体的形状、体积和化学性质，在稳定的人工蛋白质骨架中构建与小分子互补的结合口袋。该方法结合体积筛选、侧链重排、分子对接与结构预测，能够在有限计算成本下搜索大量潜在序列，并将最终实验测试数量缩减至个位数。

研究人员针对五种具有不同大小和极性的合成及天然发色团设计结合蛋白，仅通过少量候选实验便获得了具有微摩尔级或更高亲和力的稳定蛋白质。X射线晶体结构表明，即使在没有配体的情况下，设计蛋白仍能够维持预先组织的结合口袋。进一步研究利用该方法构建了具有选择性识别能力的蛋白质、能够实现双发色团能量转移的模块化蛋白，以及可用于活细胞亚细胞结构成像的人工荧光蛋白。研究证明，简单且可解释的物理化学设计策略能够有效支持功能性小分子结合蛋白的快速开发。

小分子结合蛋白广泛参与天然生物体系中的分子识别、信号传导和代谢调控，也是开发生物传感器、催化蛋白及新型分子工具的重要基础。通过从头蛋白质设计构建具有特定小分子识别能力的结合口袋，可以使研究人员摆脱天然蛋白质功能和结构的限制，获得具有预定结合性质的人工蛋白。

然而，小分子与蛋白质之间的结合涉及复杂的空间和化学相互作用。稳定结合不仅要求配体能够进入蛋白质内部，还需要结合口袋在形状、体积、疏水性及氢键分布等方面与目标分子相匹配。微小的侧链排列变化就可能影响结合亲和力和选择性。

此前，基于Rosetta等工具的计算设计方法已经成功构建了能够识别地高辛、阿哌沙班和卢卡帕利等小分子的人工结合蛋白，但往往需要大量计算筛选或后续实验进化才能获得较高亲和力。

近年来，RFdiffusion及其他生成式蛋白质设计方法进一步扩大了可探索的蛋白质结构空间，但对于小分子结合设计而言，生成大量候选结构并不意味着能够准确判断哪些设计最终具有实验活性。尤其当配体具有复杂的形状和化学性质时，蛋白质骨架、侧链排布及结合姿态之间的组合空间非常庞大。

研究人员因此重新考虑这一问题：与其从头搜索完整的蛋白质折叠结构，是否可以选择已经充分表征、具有较高稳定性的人工蛋白质骨架，通过快速评估配体与局部侧链的几何及化学互补性，直接获得具有结合功能的蛋白质？

基于这一思路，研究人员开发了RASSCCoL，将蛋白质结合口袋设计简化为在稳定骨架内部选择合适的侧链组合，并进一步验证这种方法能否用于设计选择性结合蛋白和具有实际功能的人工生物分子。

研究人员建立了RASSCCoL计算设计流程，以稳定的单链α螺旋束蛋白sc-apCC-4和六螺旋桶状蛋白sc-apCC-6作为初始骨架，并选择DPH、尼罗红、光黄素、Arcyriaflavin A及SN38等具有不同体积、极性和化学官能团的小分子作为设计靶标。首先，根据配体长度和蛋白质疏水核心的分层结构确定需要重新设计的氨基酸位置，再利用基于原子范德华半径的体积计算筛选能够形成形状互补结合口袋的侧链组合。随后使用FASPR进行侧链重排，通过AutoDock Vina预测配体结合姿态和相互作用能，并结合AlphaFold2重新预测蛋白质结构，对候选序列进行筛选。对于较大的序列搜索空间，研究人员引入基于梯度提升树的主动学习策略，优先评估具有较好预测结合能力或较高模型不确定性的候选序列，以减少显式分子对接次数。实验验证包括蛋白质表达纯化、荧光强度及荧光偏振结合实验、圆二色谱、X射线晶体学、小角X射线散射和荧光寿命测量。最后，通过融合不同配体结合模块构建双结构域蛋白，并利用HeLa细胞荧光成像与荧光寿命成像验证设计蛋白在活细胞中的应用能力。

研究人员首先建立了一种基于配体体积与蛋白质侧链排布关系的快速设计方法，并选择已经具有明确折叠结构的四螺旋束蛋白sc-apCC-4作为初始骨架。

该蛋白质具有稳定的疏水核心，其内部侧链呈分层排列，每层包含四个主要侧链，相邻层之间的距离约为5 Å。这种规则结构使研究人员能够根据配体长度估算所需改造的核心层数，再通过替换部分氨基酸侧链形成结合口袋。

研究首先选择疏水性荧光分子1,6-二苯基-1,3,5-己三烯（DPH）作为模型配体。DPH长度约为15 Å，体积约为274 ų，因此需要在四螺旋束内部重新设计三个连续的疏水核心层。

在保留部分维持蛋白质稳定性的异亮氨酸残基后，研究人员选择10个核心位置进行重新设计，并将可用氨基酸限制为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。理论上，这些位置能够产生约1000万种不同序列组合。

如果逐一对所有序列进行完整结构建模和分子对接，计算成本将十分高昂。因此，RASSCCoL首先根据配体体积、结合口袋体积及分子对称性进行快速筛选，将约1000万种组合压缩至约3200种候选序列。

随后，研究人员利用FASPR将这些序列对应的侧链排列到原始蛋白质骨架中，再通过AutoDock Vina评价配体的结合姿态和预测结合能。最后，对评分较好的少量候选使用AlphaFold2重新预测结构，并再次开展分子对接。

整个DPH设计流程仅需单个CPU核心约30分钟即可完成。对于结构更加不对称的尼罗红分子，体积筛选后仍有约40万种候选序列，但通过多线程计算，也能够在两小时内完成主要筛选。

这一结果说明，利用稳定蛋白质骨架和简单的体积互补条件，可以在不显式搜索大量主链构象的情况下，大幅降低小分子结合口袋设计的计算复杂度。

图1｜RASSCCoL基于配体体积、侧链重排和分子对接的快速蛋白质结合口袋设计流程。

在建立计算流程后，研究人员进一步考察RASSCCoL能否适用于具有不同结构、极性及化学官能团的小分子。

研究选择了五种代表性配体，包括疏水性荧光分子DPH和尼罗红，以及具有更强极性或生物活性的光黄素、Arcyriaflavin A和SN38。这些分子的体积约为257–396 ų，能够检验方法对不同尺寸和化学性质配体的适用性。

对于含有较多极性官能团的配体，研究人员在结合口袋设计中增加了丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸等极性氨基酸，使口袋能够在保持形状互补的同时形成潜在氢键相互作用。根据计算评分，研究人员总共仅选择13个候选序列进行实验表征。其中DPH、尼罗红和Arcyriaflavin A各测试2个设计，光黄素测试3个，SN38测试4个。

实验结果显示，所有设计蛋白均能够良好表达，并保持单体状态、α螺旋结构和较高的热稳定性。荧光结合实验进一步证明，不同候选能够识别相应的小分子配体。其中，最佳DPH结合蛋白的解离常数约为1.2 μM，尼罗红为2.4 μM，Arcyriaflavin A达到0.11 μM，SN38约为7.8 μM。相比之下，光黄素结合蛋白的亲和力较弱，解离常数高于50 μM。

研究人员认为，光黄素相对较低的脂溶性和较小的疏水表面积，可能使其难以从主要依赖疏水相互作用的结合口袋中获得足够的结合能。值得注意的是，部分设计蛋白已经表现出一定的配体选择性。例如，针对DPH或尼罗红设计的疏水结合口袋不能有效结合体积更小但极性更强的光黄素，说明体积匹配并不足以决定分子结合，化学环境的互补性同样重要。

研究人员还利用LigandMPNN与Boltz2对部分候选进行进一步序列优化，但发现更复杂的计算设计并不一定改善结合能力。尽管一个Arcyriaflavin A优化变体获得了低于2 nM的亲和力，其他部分候选的亲和力没有明显提高，甚至失去了可检测的结合能力。因此，后续研究主要采用最初通过RASSCCoL获得的设计，以评估这一简化方法本身的实用性。

图2｜RASSCCoL针对五种不同小分子配体设计结合蛋白及其实验亲和力评价。

蛋白质能否按照计算模型形成预期的结合口袋，是决定小分子识别功能的重要因素。研究人员因此进一步利用X射线晶体学检验设计结构的准确性。

研究成功解析了五种代表性人工结合蛋白的无配体晶体结构，分辨率约为1.7–2.4 Å。这些结构与AlphaFold2预测模型高度一致，蛋白质主链Cα均方根偏差均小于0.5 Å。更重要的是，尽管晶体结构中不存在目标配体，设计结合口袋仍然保持了预期形状。结合位点侧链重原子与计算模型之间的均方根偏差同样小于0.5 Å，说明局部侧链排布并未在缺少配体后明显塌陷。例如，尼罗红结合蛋白的晶体结构分辨率达到1.7 Å，其结合位点侧链重原子偏差约为0.33 Å；光黄素和Arcyriaflavin A结合蛋白的相应偏差分别约为0.30 Å和0.35 Å。

这些结果说明，RASSCCoL能够利用稳定蛋白质骨架构建预先组织的结合口袋，而不需要依赖配体结合后产生大幅构象调整。不过，研究人员未能获得配体结合状态下的蛋白质复合物晶体，因此尚无法直接通过实验结构确定所有配体的真实结合姿态。通过Boltz2预测，研究获得了与设计口袋一致的配体构象，并观察到部分极性配体与引入的侧链之间形成潜在氢键。

总体而言，晶体结构验证了设计蛋白质骨架和结合口袋的准确性，为解释其小分子结合能力提供了重要结构依据。

图3｜人工小分子结合蛋白的无配体晶体结构及与计算设计模型的原子级比较。

随着结合口袋中可设计氨基酸位置增加，潜在序列数量会迅速增长。为使RASSCCoL能够处理更大的蛋白质骨架，研究人员进一步引入主动学习策略，减少需要进行完整分子对接的候选数量。

研究人员比较了梯度提升树、随机森林及线性模型等方法，通过少量已经完成分子对接的序列训练预测模型，再根据结合评分和模型不确定性选择后续需要计算的候选。在包含数千万种候选序列的测试中，梯度提升树表现最好。该方法仅需对不到5%的序列进行模型训练，即可有效识别高评分候选。在两个测试数据集中，模型分别恢复了排名前2500的候选中的92%和99%，同时将计算成本降低超过10倍。

随后，研究人员将这一策略应用于具有六条α螺旋的人工蛋白质sc-apCC-6。该骨架具有较大的疏水核心，能够容纳更多不同侧链，并允许使用苯丙氨酸等体积较大的氨基酸。研究目标是设计两种不同的结合蛋白：一种能够同时识别DPH和尼罗红，另一种则优先识别尼罗红而排斥DPH。

经过体积筛选，约130万种候选序列满足初始几何条件。研究人员利用主动学习，仅对约13万种序列进行显式分子对接，随后从中选择两个设计进行实验验证。结果显示，非选择性结合蛋白对DPH和尼罗红的解离常数分别约为1.9 μM和2.2 μM，具有相近的结合能力。

相比之下，选择性结合蛋白对尼罗红的解离常数达到0.11 μM，而对DPH的亲和力弱于20 μM，两者相差约170倍。结构分析表明，选择性主要来自结合口袋长度的微小变化。由于DPH比尼罗红长约2 Å，设计引入的亮氨酸和苯丙氨酸缩短了口袋的有效空间，使DPH在结合时产生明显的空间冲突，而尼罗红仍能够被有效容纳。

这一实验表明，小分子结合蛋白的选择性可以通过精细控制口袋几何形状实现，不一定需要复杂的氨基酸序列改造或大规模实验进化。

图4｜主动学习辅助的大规模结合口袋设计及对DPH和尼罗红的选择性识别。

在获得具有不同小分子识别能力的蛋白质后，研究人员进一步探索能否将独立的结合模块组合成具有更加复杂功能的人工蛋白质。

研究人员选择能够分别识别DPH和尼罗红的两个四螺旋束蛋白，通过刚性α螺旋连接臂将其融合为双结构域蛋白，使两个结合口袋在空间上保持预定距离。由于DPH和尼罗红能够组成荧光共振能量转移（FRET）供体–受体体系，研究人员希望利用蛋白质结构控制二者的空间排列，实现从DPH向尼罗红的能量传递。

计算设计将两个发色团之间的距离设置在约50 Å范围内。实验表明，融合蛋白能够稳定表达，并保持单体和α螺旋结构。小角X射线散射结果进一步证实，其整体形状与计算模型相符。结合实验显示，双结构域蛋白仍能够分别结合DPH和尼罗红，对应解离常数约为1.3 μM和0.53 μM，说明两个功能模块在融合后基本保留了各自的配体识别能力。

在同时加入两种配体后，研究人员选择性激发DPH，观察到尼罗红产生延迟荧光发射，表明能量能够从DPH转移至尼罗红。荧光寿命分析得到的能量转移时间约为2.0 ns，据此推算两个发色团之间的距离约为51 Å，与计算设计及分子动力学模拟结果高度一致。

这一结果证明，RASSCCoL获得的结合模块不仅可以独立发挥作用，还能够通过结构组合形成具有预定空间关系和功能耦合的人工蛋白质，为设计多组分分子传感器和光学功能蛋白提供了基础。

图5｜模块化双结构域人工蛋白的设计及DPH向尼罗红的荧光共振能量转移验证。

研究人员最后考察RASSCCoL设计的结合蛋白能否作为细胞内荧光成像工具使用。

传统荧光蛋白通常通过自身发色团产生荧光，而设计的小分子结合蛋白可以通过识别外源荧光染料实现发光，从而使蛋白质结构与发色团性质分别优化。研究人员发现，部分四螺旋束设计蛋白仅包含约130个氨基酸，分子量约15 kDa，明显小于常用GFP变体。同时，将尼罗红结合于适当的疏水口袋后，能够显著提高其荧光量子产率并延长荧光寿命。例如，尼罗红结合于sc-apCC-4-SN38-1后，荧光量子产率达到约0.9，荧光寿命约为4.8 ns，表现出较高亮度及较长寿命。

随后，研究人员将设计蛋白与mEmerald融合，并通过不同定位信号引导其进入细胞核、细胞膜和肌动蛋白网络。在HeLa细胞中，加入低浓度尼罗红后，具有结合能力的设计蛋白能够富集染料，并在相应亚细胞位置产生与蛋白定位一致的荧光信号。相比之下，不具有尼罗红结合能力的原始蛋白质骨架不能产生相同的特异性共定位现象。

进一步通过荧光寿命成像发现，尼罗红在设计结合蛋白附近的寿命约为4.4–4.5 ns，与体外结合状态下的测量结果接近，而对照蛋白中的荧光寿命约为3.6–3.7 ns。研究人员还发现，即使去除辅助荧光蛋白mEmerald，设计结合蛋白仍能够通过尼罗红实现目标亚细胞结构的成像，说明其本身已经具备作为人工荧光蛋白标签的潜力。

这些结果将RASSCCoL的应用从体外小分子结合扩展至活细胞成像，证明经过合理设计的结合口袋能够作为构建新型生物成像工具的功能基础。

图6｜从头设计小分子结合蛋白在活细胞亚细胞定位与荧光寿命成像中的应用。

本研究提出的RASSCCoL展示了一种不同于大规模生成式结构搜索的小分子结合蛋白设计思路。研究人员没有从头生成完整蛋白质折叠，而是选择结构稳定、内部侧链排列规律明确的人工α螺旋骨架，通过体积匹配、侧链替换和分子对接，直接构建与目标配体互补的结合口袋。

这一方法的突出优势在于计算成本低、设计过程容易解释，并且能够通过极少量实验候选获得实际结合功能。晶体结构表明，设计口袋在缺少配体时仍能保持预先组织的侧链构象，说明稳定骨架与局部侧链设计的结合能够有效降低蛋白质结构变化带来的不确定性。

此外，研究证明了结合口袋的微小形状变化可以产生明显的配体选择性，并通过模块化组合实现双发色团之间的可控能量转移。设计蛋白还能够在哺乳动物细胞中富集荧光染料，用于观察特定亚细胞结构，表明这类人工结合模块具有进一步开发为生物成像与分子传感工具的潜力。

不过，当前研究主要集中于具有规则α螺旋结构的人工蛋白骨架及一组发色团配体。对于结构更加柔性、极性更强或需要复杂构象调整的小分子，结合口袋设计仍可能面临挑战。此外，部分设计蛋白的亲和力仍处于微摩尔水平，计算评分与实际结合性能之间也存在差异。

总体而言，RASSCCoL证明，通过合理利用稳定蛋白质骨架和简单的物理化学互补性约束，可以快速获得具有明确小分子结合功能的人工蛋白，并进一步将这些结合模块应用于选择性分子识别、能量转移和活细胞成像。

Petrenas, R., Ożga, K., Chubb, J.J. et al. Rapid assessment of chemical complementarity of ligands for protein design. Nat Commun (2026). 

https://doi.org/10.1038/s41467-026-78764-7